I. Genetické minimum - chromozómové choroby a ich diagnostika
Ďurovčíková Darina
Klinika lekárskej genetiky SZU a FNsP, Bratislava
Úvod
Genetické choroby vznikajú v dôsledku mutácii na úrovni génu, alebo väčšej časti genómu, v interakcii s exogénnymi faktormi. Výskyt geneticky podmienených patologických stavov ( tab.1), alebo predispozícia k nim sa podľa viacerých štatistík odhaduje na 12-15% (1,2).
Etiologickú rôznorodosť spôsobujú rôzne typy genetických defektov, detekcia ktorých si vyžaduje špecifické laboratórne metódy (tab.1). V ostatnom čase sme zaznamenali ich významný pokrok, týkajúci sa najmä rozvoja genetických diagnostických testov, ktoré majú priamy dopad na manažment komplexnej starostlivosti o pacientov a rizikových členov rodiny. Pre včasnú diagnostiku a prevenciu genetických ochorení je dôležité vzdelávanie a transfer poznatkov do praxe každého lekára. Potrebe začlenenia najnovších poznatkov z medicínskeho výskumu a genetiky do pregraduálneho a postgraduálneho vzdelávania sú venované osobitné príspevky na blížiacej sa konferencii AMEE (Association of Medical Education in Europe). Forsíruje sa dostupnosť vedomostí s cieľom rozpoznať genotypo-fenotypové korelácie najmä vo vzťahu k liečbe a celkovej zdravotnej starostlivosti (3). Iné asociácie a spoločnosti (ESHG, OECD) odporúčajú vzdelávanie v uvedených oblastiach vrátane genomiky a proteomiky zaradiť aj do mimoprofesného vzdelávania pracovníkov v zdravotníctve ako aj pre širokú laickú verejnosť. Primeraná úroveň vzdelania zbavuje neopodstatnených obáv z genetiky, ktorá je v 21.storočí neoddeliteľnou súčasťou liečebno-preventívnej starostlivosti.
S potešením možno konštatovať, že uvedené odporúčania u nás viac rokov akceptujeme. Otázky genetického testovania, algoritmy genetickej diagnostiky, správnej laboratórnej praxe, etiky a legislatívy v odbore sú náplňou pravidelných školiacich aktivít na SZU.
Zároveň sú pre nás ambíciou zaplniť priestor v tomto periodiku na pokračovanie, ktorého obsahom bude minimum genetických poznatkov. Prvú časť venujeme chromozómovým ochoreniam a prehľadu ich diagnostických metód.
I. Chromozómové choroby
Chromozómové anomálie pozorujeme ako zmeny na chromozómoch , ktoré môžu byť :
- vrodené (konštitučné)
- získané (v priebehu života napr. malígnym procesom v bunke).
Vrodené chromozómové anomálie spôsobujú zmenou počtu, alebo štruktúry chromozómov génovú nerovnováhu a upozornia na seba závažnou poruchou morfogenézy. Pre autozómové anomálie je typický výskyt VVCH spolu s mentálnou retardáciou (obr.1). Anomálie pohlavných chromozómov sprevádzajú poruchy rastu a somatosexuálneho vývinu a sú z klinického hľadiska menej závažné. Vyhľadávanie ich zvýšeného rizika sa uskutočňuje celoplošným prenatálnym biochemický skríningom ( sAFP a betaHCG ) u tehotných žien v rozmedzí 16-18 týždňa gravidity. Vrodené a získané chromozómové anomálie potvrdíme cytogenetickým vyšetrením pri ktorom sa stanoví karyotyp. Výskyt chromozómových chýb v populácii živorodených je cca 1% (2.4).
Diagnostické známky na klinickej úrovni
Na chromozómové ochorenia u novorodenca upozorňuje prítomnosť vrodených vývinových chýb (VVCH) , ktoré sú zastúpené v ich etiológii cca 5%. Signálmi pre chromozómovú anomáliu bývajú nevysvetliteľná polystigmatizácia, tonusové poruchy, rôzne patologické parametre zistené prenatálnym ultrazvukovým vyšetrením plodu ako sú: mikrocefalia, zhrubnutá nuchálna riasa, rastová retardácia a rôzne orgánové anomálie a iné. Neskôr to býva mentálna retardácia, zaostávanie rastu, pubertálneho vývinu, nástupu menštruácie a iné. V dospelosti sa konštitučná chromozómová anomália diagnostikuje skôr výnimočne. Ich záchyt pozorujeme pri vyšetrení párov pre poruchy fertility a reprodukcie v podobe anomálií pohlavných chromozómov, zriedkavých foriem malých gonozómových mozaík a vyvážených chromozómových prestávb.
Charakteristika a rozdelenie
Predstavujú odchylky od normálnej chromozómovej výbavy somatickej bunky, ktorá obsahuje 22 párov autozómov (1-22 ) a pár pohlavných chromozómov – gonozómov (XX, alebo XY). Najčastejšou príčinou vzniku aneuploidie je nondisjukcia, alebo patologické rozdelenie chromozómov v meióze, ktoré vzniká prezygoticky. Zriedkavo sú dôsledkom postzygotickej poruchy mitotického bunkového delenia. Tieto javy sú väčšinou náhodné, aj keď sa pripúšťa, že určité rodiny môžu mať sklon k nondisjuncii (asynchrónne delenie pri predčasnom delení centroméry). Len istá malá časť chromozómových anomáli vzniká zákonite v dôsledku vyvážených anomálií (prestavieb chromozómov), ktoré sa vyskytujú v populácii ich zdravých prenášačov s frekvenciou menej ako 0,2% (4)
Rozdelenie podľa (I a II) zohľadňuje typy chromozómov a konkrétne zmeny.
I. Rozdelenie podľa typu chromozómov
A./ AUTOZÓMOVÉ
B./ GONOZÓMOVÉ
II. Podľa typu zmien v počte a štruktúre chromozómov:
a/ numerické - odchýlky od normálneho počtu diploidnej sady chromozómov somatickej bunky. Môže ísť nadpočetný chromozóm z páru ( trizómia ), chýbajúci ( monozómia ), dva nadpočetné chromozómy z páru ( tetrazómia ) , násobky sady chromozómov ( triploidie ) a iné odchylky od normálneho počtu (aneuploidie ). Z autozómových anomálií k nim patrí trizómia 21 - Downov syndróm. Ide o najčastejšiu chromozómovú anomáliu, ktorej výskyt populácii je od od 1:750-1000 živorodených. Medzi ďaľšie zvyčajne neonatálne letálne trizómie patria Patauov ( trizómia 13 ) a Edwardsov ( trizómia 18 ) syndróm.
Trizómia môže byť voľná, náhodná forma s nízkym rizikom rekurencie, alebo translokačná. Táto mohla vzniknúť ako mutácia de novo, alebo dôsledkom vyváženej translokácie jedného z rodičov. Z gonozómových anomálií má najčastejší výskyt monozómia X, alebo Turnerov ( karyotyp 45,X0 ) a Klinefelterov syndróm ( karyotyp 47,XXY), ktoré sa zisťujú v čistej, alebo mozaikovej forme. Výskyt vybraných chromozómových anomálií je v tabuľke č.2.
b/ štruktúrové - charakterizuje zmena štruktúry chromozómu vizualizovateľné ako prestavby krátkeho (p) a / alebo dlhého ramienka (q) chromozómu. Patria sem chýbanie určitého úseku chromozómu (delécia), alebo zmnoženie (duplikácia) istého úseku chromozómu. Ďalej sú to premiestnenie časti chromozómu na iný (translokácia), alebo iné tvarové zmeny chromozómov ( prstencový chromozóm, izochromozóm). Príkladom autozómovej štruktúrovej anomálie je syndróm mačacieho plaču (Cri-de-Chat sy ), ktorý spôsobuje delécia úseku krátkeho ramienka chromozómu č.5 (obr.2) Zjednodušený zápis karyotypu u chlapca s týmto syndrómom je 46,XY, 5p-. Z gonozómových anomálií sa pomerne často vyskytuje prstencový chromozóm X - karyotyp 45,X r(X), alebo izochromozóm, ktorý sa u ženy manifestuje ako Turnerov syndróm (5). Submikroskopické zmeny, kryptické translokácie nie sú možné touto metódou obsiahnúť.
c/ mozaiky: predstavujú prítomnosť viacerých bunkových klonov s rozdielnou chromozómovou výbavou. Pozorujeme ich v bunkách ako rôzne chromozómové línie, nezriedka ako minoritné, s frekvenciou menšou ako 10%. Na ich detekciu je potrebné zhodnotiť väčšie množstvo mitotických figúr. Časté sú napríklad mozaikové formy Turnerovho syndrómu, Klinefelterovho syndrómu. U týchto pacientov teda nájdeme v bunkách karyotyp s normálnym a patologickým chromozómovým nálezom. Zápis karyotypu obsahuje viacero línii a začína sa zvyčajne najpočetnejšie zastúpenou. Mozaika Turnerovho syndrómu môže mať aj takýto nezvyčajný karyotyp ( 45,XO/46,XX/46,XY ). V tomto prípade prevažuje línia s chýbajúcim X chromozóm, prítomná je aj normálna a minoritná s prítomnosťou Y chromozómu. Existujú aj iné varianty s prstencovým, alebo s izochromozómom.
Genetické diagnostické testy
Chromozómové anomálie najčastejšie diagnostikujeme laboratórnymi technikami, ktoré poskytujú kompletnú analýzu karyotypu. V ostatnom čase sa klasické metódy identifikácie chromozómov dopĺňajú o nové zobrazovacie metódy, ktorými sa odhaľujú predtým nepoznané prestavby na submikroskopickej úrovni (5,6).
Klasická metóda cytogenetického vyšetrenia je založená na analýze metafázových chromozómov získaných mitotickým delením kultivovaných lymfocytoch, ktoré sa farbia konvenčne a prúžkovacími metódami (C, G, R, Q). Detekuje numerické a štruktúrové anomálie na úrovni do 550 bandov. Vyššiu rozlišovaciu schopnosť dosiahneme metódou HRT (High resolution method), kde sa hodnotia dlhšie prometafázické chromozómy. Vyšetrenie karyotypu touto metódou vyžaduje odbornú skúsenosť a pre jej náročnosť ju nahrádzajú iné modernejšie metódy farebnej cytogenetiky (6).
Klasická cytogenetika sa rutinne využíva v diagnostike konštitučných chromozómových anomálií u pacientov s vrodenými vývinovými chybami (VVCH), mentálnou retardáciou ( MR ), poruchami rastu a pohlavného vývinu, alebo pri opakovaných spontánnych potratov. V neposlednej rade aj v prenatálnej diagnostike u plodu, ktorá sa uskutočňuje po stanovení ich rizika klinickým genetikom. Gonozómové anomálie, najmä v nizkopercentnej mozaikovej forme (Turnerov, Klinefelterov syndróm) sa môžu výnimočne diagnostikovať až pri poruchách reprodukcie v dospelom veku. Klasická metóda umožní záchyt štruktúrových anomálií a mnohonásobných chromozómových prestávb, ktoré sú typické pre syndrómy chromozómovej instability s rizikom malignity. Príkladom sú Fanconiho anémia, Ataxia teleangiektázia, Nijmegenský syndróm a iné. Manifestujú sa zvýšenou lomivosťou chromozómov. Najčastejšie sa pri týchto syndrómov zistí instabilná chromozómová translokácia 7/14, spolu s inými štruktúrovými zmenami a figúrami ( gapy, breaky, triradiály, kvadruradiály), ktoré bývajú v rôznom percentuálnom zastúpení (obr.3).
Fluorescenčná in situ hybridizácia ( FISH ) metóda používa metódy molekulovej cytogenetiky. Umožní diagnostiku chromozómových prestávb na submikroskopickej úrovni ( < 800 bandov ), ktoré nie sú vizualizovateľné klasickou technikou . Ide najmä o mikrodelečné a mikroduplikačné syndrómy a pomáha tiež odhaliť nízkopercentné mozaiky. Princípom je detekcia signálov po hybridizácii pacientovej chromozómovej DNA so špecifickými sondami (centromerickými, celochromozómovým, alebo lokusovo špecifickými) použitými podľa potreby (obr.4 ). Centromerické sondy sa používajú na zisťovanie numerických chromozómových chýb s dôkazom prítomnosti centromér, telomerických sekvencií a obsahu heterochromatínu. Celochromozómové sondy hybridizujú so svojim homológom pozdĺž celého chromozómu. Sú vhodné na diagnostiku štruktúrových anomálií chromozómov ako sú translokácie, delécie, inverzie. Lokusovo špecifické, alebo génové sondy hybridizujú do oblasti hľadaných konkrétnych sekvencii. Tento typ sond, veľkosti cca 150 kb, sa využíva k diagnostike mikrodelečných syndrómov ako sú napríklad najznámejšie z nich ( Praderov-Williho, Angelmanov, Di-Georgov, Wiliamsov-Beuerenov). Výhodou tejto metódy je hodnotenie signálov na väčšom počte chromozómov aj bunkových jadier. Použitie FISH a iných DNA metód detekujúcich sekvencie v oblasti SRY chromozómu Y umožňuje pri mozaikových formách Turnerovho syndrómu vyhľadávať pacientky s rizikom gonadoblastómu.
Kombinácia klasických a molekulovo cytogenetických metód sa využíva v onkogenetike pri diagnostike a liečbe hemoblastóz, vrátane monitorovania reziduálnej choroby a postransplantačných stavoch. Chronickú myeloickú leukémiu potvrdzuje výskyt chromozómu Philadelphia, ktorý vzniká v dôsledku translokácie medzi dlhými ramenami
Iné modifikované techniky
CGH - Komparatívna genómová hybridizácia je založená na porovnávaní dvoch fluorescenčne značených vzoriek DNA ( referenčnej a pacientovej), ktoré hybridizujú s normálnymi metafázovými chromozómami. Pacientová testovaná DNA je značená zeleným flurochrómom a referenčná vzorka ( DNA od zdravého jedinca s normálnym karyotypom ) sa označuje červeným. V pomere 1:1 sa obidve nechajú hybridizovať na preparáte s normálnymi chromozómami. Nerovnováhu v testovanej vzorke zistíme vyhodnotením pomeru intenzity zelenej a červenej fluorescencie pomocou špeciálneho softwaru. Využíva sa v nádorovej cytogenetike na skrínovanie chromozómovej nerovnováhy. Metóda však presnejšiu identifikáciu prestavby neumožňuje.
Multicolor FISH- mnohonásobná farebná fluorescentná in situ hybridizácia K detekcii zmien sa používa zmes rozdielne značených sond 5 fluorochrómami a ich vzájomnou kombináciou, čím sa docieli rozlíšenie všetkých chromozómov. Na vyhodnotenie je potrebná digitálna zobrazovacia mikroskopia s filtrami, CCD kamera a počítačový software k analýze obrazu. Na základe fluorochrómovej kompozície sa každému chromozómu určí tzv.pseudofarba..Táto metóda sa používa na identifikáciu zložitejších translokácií a prestavieb medzi viacerými chromozómami. Neumožňuje detekciu vnútrochromozómových zmien typu inverzií a malých delécií.
SKY - spektrálne karyotypovanie je variantom mnohofarebnej FISH, každému chromozómu je tiež pridelená pseudofarba. Kombinuje snímanie obrazu trojakým filtrom CCD kamerou s Fourierovou spektroskopiou a príslušným počítačovým programom.
mBAND - metóda mnohonásobného pruhovania - je založená na podobnom princípe ako FISH. Podstatou m.-pruhovania je označenie jedného chromozómu viacerými značenými sondami. V kombinácii sa tiež používa 5 fluorochrómov. Každá sonda hybridizuje s inou časťou chromozómu. Na základe hybridizačných signálov dochádza k tvorbe priečnych farebných pruhov po celej dĺžke chromozómu.
Záver: Zlatým štandardom klinickej cytogenetiky je vyšetrenie karyotypu klasickou metódou. S pribúdajúcimi dôkazmi o výskyte submikroskopických chromozómových zmien, kryptických prestávb modernými laboratórnymi technikami sa zvyšuje pravdepodobnosť odhaliť kauzálnu súvislosť s etiologicky neobjasnenou mentálnou retardáciou a polystigmatizáciou.
Literatúra:
1. Smith, C. J., Donnai , D.: Human malformation. In: Emery and Rimon´s Principles and Practice of Medical Genetics. 3.vyd. New-York: Churchill Livingstone, 1998, s. 687 - 696.
2. Thompson and Thompsonová : Genetics in medicine, W.B.Saunders company, 6-th Ed., 2001, s.443.
3. Internetové adresy: www.amee.org
4. VOGEL, F., MOTULSKY, A.G. Human Genetics. 3. vyd .Berlin-Heidelberg: Springer - Verlag , 1997, s 370 -376 .
5. Izakovič V. a kolektív: Cytogenetika v klinickej endokrinológii., Osveta Martin, 1972, 320 s.
6. Černáková I., Ďurovčíková D., Brozmanová, M.: De novo tandem duplication 15q21-26 identified by FISH. Cytogenet.Cell. Genet.,Vol.85,1999, Suppl.1., s.144
Tab.1 Geneticky podmienené patologické stavy
Chromozómové ( 0,6 – 0,9 %)
Monogénové ( 0,8% )
AD, AR, X-viazané
Multifaktoriálne ( polygénne dedičné)
a/ izolované VVCH ( 3-5% )
b/ choroby dospelého veku ( 5% )
Genetické poruchy somatických buniek
Mitochondriálne dedičné
____________________________________________
Celkový výskyt v populácii živorodených : 12 -15%
Tab. 2 Populačná frekvencia chromozómových syndrómov
( na 1000 živorodených )
Trizómia 21 (Downov ) |
1,5 |
Trizómia 18 (Edwardsov ) |
0,12 |
Trizómia 13 (Patauov) |
0,07 |
47,XXY (Klinefelterov) |
1,5 |
45,X (Turnerov ) |
0,4 |
XYY sy |
1,5 |
XXX sy |
0,65 |
Komentáře
Přehled komentářů
Таможенное декларирование грузовых колес из Поднебесной вероятнее может вызывать определенные сложности у коммерсантов. Таможенный агент «ВЭД ЛАЙН» https://ved-line.ru оказывает целый спектр таможенных услуг в данной деятельности. Присутствие в штате профессионалов в области таможенного законодательства способствует совершать таможенное оформление в самые маленькие сроки. Любая продукция из Китайской Народной Республике кропотливо досматривается сотрудниками таможенных органов. В обязательном режиме нужно пройти регистрацию таможенной декларации на товары при этом следует правильно подобрать коды ТН ВЭД ЕАЭС. Импортеру необходим будет коммерческое предложение от продавца, пакет документов на компанию, сертификаты соответствия, платежные поручения, упаковочный лист и иные документы. Выбор кода на основе ТН ВЭД, проведение расчетов таможенных платежей, осуществление легальной оптимизации, проверка внешнеэкономического контракта, сбор всех необходимых документов а также разрешений для таможенного оформления, оказание дополнительных консультационных услуг.
Base for Xrumer
(BaseXrumerVef, 23. 7. 2022 20:41)
Самая большая база для Xrumer с бесплатными обновлениями каждый месяц в течении 12 месяцев.
Объем базы более 100 000 000 сайтов. Размер более 33 гигабайт.
База структурирована по разделам для удобства. С данной базой отпадет необходимость покупать дополнительные базы.
Подробнее можно о базе можно узнать по ссылке:
https://mipped.com/f/threads/samaja-bolshaja-baza-dlja-xrumer-s-avtoobnovleniem.207352/
Услуги по прогону и раскрутке сайтов Xrumer можно заказать тут https://kwork.com/user/ElitestaR
внутренняя канализация в частном доме
(Antoniowmz, 20. 7. 2022 11:49)
Здравствуйте друзья!Есть такой замечательный сайт для заказа бурения скважин на воду. Бурение скважин в Минске компанией ЕВРОБУРСЕРВИС – полный комплекс качественных и разумных по цене услуг. Мы бурим любые виды скважин.У нас доступная ценовая политика, рассрочка на услуги и оборудование.Заказывайте скважину для воды в euroburservice – получите доступ к экологически чистой природной воде по самым выгодным в Минске ценам! Вода, независимо от глубины скважины, качается насосом. Насос опускается на глубину, которая зависит от характеристик скважины (статики и динамики) и производительности насоса. К насосу подсоединен питающий электрокабель и труба. Насос опускается закрепленным на страховочный трос, который надежно фиксируется на оголовке или скважинном адаптере. Оголовок — закрывает устье скважины (ее выход на поверхность). Оголовок герметизирует и защищает устье. Он надежно закрывает скважину и исключает кражу насоса и другого оборудования. Автоматическое оборудование по раздаче воды (автоматика) мы помещаем не на открытом воздухе, а внутри герметичного короба – кессона, или в доме. Кессон опускается на 2 м (это глубина промерзания грунта зимой), грунт на эту глубину извлекается, это исключает ситуации замерзания воды или попадания водостоков. Все происходит в такой последовательности: сначала вокруг пробуренной скважины удаляем грунт и устанавливаем кессон, затем внутри кессона – оголовок, к оголовку при помощи карабина и страховочного троса прикрепляем насос, его опускаем в скважину.
Увидимся!
https://carbis.ru/forum/member.php/274453-Antoniojmq
https://planetbarbarus66.net/member.php?u=993548
https://ladygrand.ru/entry.php?1116-%CA%F3%EF%E8%F2%FC-%ED%E0%F1%F2%EE%FF%F9%E8%E9-%E4%E8%EF%EB%EE%EC-%E8%EB%E8-%E0%F2%F2%E5%F1%F2%E0%F2&bt=171913
https://www.thegamesmachine.it/forum/members/97939.html
https://floobits.com/Antoniokwy
First flirt man site
(Jasmineinero, 20. 7. 2022 1:15)Flirt In Love - https://2track.info/kJwk
In my opinion, it is an interesting question, I will take part in discussion.
(TommyLax, 17. 7. 2022 18:35)
Curiously....
https://film-spark.com
https://itaphim.com
It is visible, not destiny.
(TommyLax, 17. 7. 2022 18:35)
I am sorry, that has interfered... But this theme is very close to me. Write in PM.
https://tumblindice.org
https://gayatlcp.org
10 тыс друзей Vkontakte
(ArtinsSit, 8. 7. 2022 16:59)
Тут можно получить бесплатный плагин для Chrome, которое позволит быстро накрутить клиентов vk.com так, чтобы избежать заморозки аккаунта:
https://youtu.be/xP-o5KUzQoM
XEVIL 5.0: Byl vydán nejlepší program pro řešení captchas !
(Ritaferm108, 29. 6. 2022 15:26)
XEvil 5.0 automaticky řeší většinu druhů captchas,
Včetně takového typu captcha: ReCaptcha v.2, ReCaptcha-3, Hotmail, Google, Solve Media, BitcoinFaucet, Steam, +12k
+ hCaptcha podporováno v novém XEvil 6.0! Stačí vyhledat XEvil 6.0 na YouTube
Máte zájem? Jen google XEvil 6.0
P.S. Zdarma XEvil Demo je k dispozici !!!
Taky, do 30. července je k dispozici Obrovská sleva: -30%!
XEvil.Net
Zkontrolujte nové video na YouTube:
"XEvil 6.0 <Beta>1] + XRumer multhithreading hCaptcha test"
газобетон
(RonaldRaind, 27. 6. 2022 22:38)
Реализация стройматериалы в Москве,
Московской области и ближайших регионах.
Одно из основных направлений - реализация
блоков из газобетона различных брендов
Газобетон Евроблок
газосиликат
https://gazobeton-moskva.ru/
Выкуп автомобилей Jeep в СПБ
(Andrewdiast, 27. 6. 2022 18:31)https://vukypavto.ru/ - Срочный выкуп отечественных машин марки Liebao Motor модели Roadmaster, 1941 года выпуска, тип кузова пикап с объемом двигателя 1195 коробка передач вариатор в Санкт-Петербурге.
We are looking for new team members
(AnnieEnhax, 27. 6. 2022 12:24)
Our business is expanding so we are in the need for more remote workers.
What you will be doing: As a live chat assistant you will be paid to reply to live chat messages on a business's website or social media accounts.
This includes:
- answering customer questions,
- providing sales links,
- and offering discounts.
Full training is provided so you don’t need any previous related experience. Contract length: No fixed term
Rate: $0.50 per minute ($30 per hour)
Skills/background needed:
- Must have a device able to access social media and website chat functions (Phone/Tablet/Laptop).
- Be able to work independently.
- Ability to closely follow provided steps and instructions.
Reliable internet connection.
Hours per week: Flexible
Location: Remote work online (preferred)
For more information: https://bit.ly/_job_offer
Have a great rest of the day,
Ann
We are looking for brand-new staff member [SPOT OFFER]
(NathanCax, 26. 6. 2022 16:10)
My company is increasing in size so we remain in the need for even more remote workers.
What you will certainly be doing: As an online conversation assistant you will be paid to reply to live conversation messages on a service's site or social media sites accounts.
This consists of:
- answering client concerns,
- supplying sales web links,
- as well as using price cuts.
Complete training is given so you do not require any kind of previous associated experience. Contract length: No set time
Price: $0.50 per min ($ 30 per hr).
Skills/background required:.
- Must have an equipment able to access social and site chat features (Phone/Tablet/Laptop).
- Have the ability to work separately.
- Capacity to carefully adhere to offered steps as well as directions.
Reliable internet link.
Hours per : Flexible.
Area: Remote job online (favored).
To learn more: https://4dct.short.gy/little.social_jobs
Have great workday,
Nathan
Выкуп автомобилей УАЗ в СПБ
(Andrewdiast, 25. 6. 2022 17:46)https://vukypavto.ru/ - Срочный выкуп иностранных автомобилей марки Batmobile модели Largus, 2002 года выпуска, тип кузова фаэтон с объемом двигателя 800 коробка передач робот в Питере.
Таможенное оформление в россии
(appops, 24. 6. 2022 4:55)Итак, подумайте, словно вы рассчитываете поставлять грузы, предположим, мебель, из одного из главных портов Поднебесной, будь это Шанхай, Нинбо, Циндао или Тяньцзинь, и хотите отправить их в один из больших портов России Владивосток. Но сейчас мы намереваемся использовать один наглядный пример и импортировать одну паллету из Тяньцзинь во Владивосток товаров народного потребления, скажем, немного мебели. И прежде чем мы начнем, меня зовут Юрий. Я работаю в экспедиторской компании «ВЭД ЛАЙН» https://ved-line.ru и мы импортируем все группы товаров из Китайской Народной Республики в Российскую Федерацию, и мы будем рады помочь вам отреагировать на любые ваши запросы. Поэтому не стесняйтесь писать свои вопросы на эл.почту, и я отвечу на каждый из них. Итак наиболее приоритетное, прежде чем импортировать какие-нибудь товары в Россию, заведомо, договориться с вашим зарубежным экспортером об условиях поставки Инкотермс 2020. Наиболее массовый и, я бы назвал, наиболее общедоступный отмечается FOB (Free On Board). А для тех, кто не понимает различий между различием условием поставок, ознакомьтесь с ним, потому что он описывает разные стороны среди Инкотермс. Например, вы договорились с вашим поставщиком в Китае Free On Board Тяньцзинь и израсходовали за товар десять тысяч долларов, а это один кубометр, одна паллета, 300 кг брутто, это в среднем. Будем использовать это в качестве образца. Главная и самая важная услуга, за которую вам нужно рассчитаться, называется морской фрахт. А примерно, опять-таки, будет привязываться от курса, но давайте выделим 50 долларов за куб. Так что это начальная цена, которую вы должны уплатить. Вторая стоимость, которую вам необходимо оплатить, как только товар приплывет в морской порт Владивостока, конечно, вы должны позаботиться и определить внутритерминального агента во исполнение перемещения контейнера на склад. И здесь, конечно, портовик должен выгрузить весь контейнер, потому что, когда вы отгружаете всего один паллет с грузом, вы делите контейнер с разными грузополучателями. И у вас есть, скажем, 10 или 20 разных импортеров, и каждый выплачивает свою долю за свой товар. Третья сумма, за которую вам следует заплатить, бесспорно, находится в следующем, вам требуется назначить таможенного агента, который совершит для вас таможенное декларирование. Если вы ни разу этого не совершали, вы не сумеете сделать это собственными силами, вот почему обязательно направьтесь к таможенному специалисту по меньшей мере за три недели до прихода во Владивосток.
Yes, really. It was and with me. Let's discuss this question. Here or in PM.
(TommyLax, 19. 6. 2022 23:27)
The matchless answer ;)
https://tumblindice.org
https://graphixadventure.com
I think, that you are mistaken. I can prove it. Write to me in PM.
(TommyLax, 19. 6. 2022 11:39)
Yes, all can be
https://reuniteloverspells.com
https://gayssingles.org
I am final, I am sorry, but it is necessary for me little bit more information.
(TommyLax, 19. 6. 2022 11:38)
I thank for the information.
https://biggaysingdublin.com
https://dotorgfoundation.org
Перевозка лежачих больных
(TimothyFaive, 13. 6. 2022 6:38)
Платная трнспортировка беззащитных больных в течение Москве — очень потребованная услуга у сродственников людишек вместе с узкими способностями, пожилых бабулек (а) также дедушек, инвалидов. Государственная скорая помощь помощь или реанимобиль не приедет, если недвижимому человеку требуется поехать сверху обследование, в течение больницу буква врачу, на отдохновение на частичный пансион или срочно что поделаешь сверху речвокзал чи аэропорт. Поэтому всходит вопрос — как транспортировать маломобильного пассажира? Чтобы данного к предложениям москвичей коммерческий услуги милосердного также санитарного такси.
перевозка на скорой лежачих больных
https://moskva-perevozka-bolnyh-24.ru/
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 | 26 | 27 | 28 | 29 | 30 | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 | 41 | 42 | 43 | 44 | 45 | 46 | 47 | 48 | 49 | 50 | 51 | 52 | 53 | 54 | 55 | 56 | 57 | 58 | 59 | 60 | 61 | 62 | 63 | 64 | 65 | 66 | 67 | 68 | 69 | 70 | 71 | 72 | 73 | 74 | 75 | 76 | 77 | 78 | 79 | 80 | 81 | 82 | 83 | 84 | 85 | 86 | 87 | 88 | 89 | 90 | 91 | 92
Таможенное оформление декларант
(appops, 27. 7. 2022 23:18)